身负重任的猪：让异体移植离临床更近

　　来源：中国科学报



　　本报记者 袁一雪

　　在中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组用于研究的养猪场里，生活着一群特别的猪。这里不仅有十几头带有基因剪刀的工具猪，而且拥有六七百头其他在生物医药领域具有重要应用价值的基因修饰猪。而这些猪的用途听起来更加“骇人”，有些基因修饰猪可以模拟人类疾病，如老年痴呆症、渐冻人症和亨廷顿舞蹈症等，有些猪可为人体器官移植提供异种器官来源。

　　异种器官移植一直是国际研究的重点方向之一。如果这一重大难关能够攻克，将会为全世界需要器官移植的上百万病人带来希望。

　　令人兴奋的是，这道通往希望的大门正在悄然打开――不久前，赖良学课题组在国际权威杂志《基因组研究》上发表了一篇关于构建了条件性表达Cas9基因新型工具猪模型的论文。


广州生物院首次培育出的带有基因剪刀的工具猪

　　为何选择猪

　　要了解这项研究，先得从Cas9基因说起。

　　Cas9基因与CRISPR技术曾经在寨卡病毒暴发时大显身手，被用于监测寨卡病毒，甚至还能用来检测SARS、SARS冠状病毒、麻疹病毒、流感病毒、丙肝病毒等。前者是基因中的一种核酸酶，后者则是“规律成簇间隔短回文重复”的英文缩写，来自细菌体内，肩负着细菌免疫的“重任”。

　　在CRISPR利用病毒DNA自行转化后驱逐这种病毒的过程中，Cas9是关键的核酸酶。不过这次，两者联手却不是要检测病毒，而是被研究人员在猪身上“埋入”一个可以世代遗传的“秘密”，让它肩负起更大的使命。

　　这个秘密就是研究人员通过定点修改猪的基因组，为实验打开“方便之门”。

　　一直以来，医学技术的进步离不开实验动物的牺牲。这是因为要获得有关生物学、医学等方面的新知识或解决具体问题，人类无法在自身上实验，只能在实验室使用动物进行科学研究。

　　在用于实验的动物中，既有小鼠、大鼠、兔子等小动物，也有猪、猩猩、狒狒等大动物。不过，因为大动物的孕育期、生长期和性成熟期较长，不如小鼠、大鼠、兔子等小动物繁殖时间短。“如果做基因实验，就需要在胚胎期间更改基因，再放入代孕母体内，等待降生。”赖良学告诉《中国科学报》记者，“小鼠的孕期是21天，4周可性成熟，继续繁殖下一代。但猪的孕期就有114天左右，性成熟期则需要6~8个月。”所以研究人员往往会选择孕育期较短的小型动物，以便早日看到实验结果。

　　只是，使用小型动物虽然缩短了时间，却因为小型动物与人体的差别较大，所以实验结果往往无法直接用在人身上。那么谁可以肩负重任，与人类相近，让实验更接近于真实呢？

　　在众多哺乳动物中，猪虽然与人的血缘不近，但其器官大小、形态结构、生理代谢和免疫系统等与人类非常接近；再者，猪是人类饲养的家畜，数量比狒狒、猩猩等灵长类动物更多，没有伦理方面的障碍，所以猪是目前比较理想的实验动物。

　　但问题是，如果想根据实验目的敲掉其中特定基因，研究人员又必须从动物胚胎期开始实施，待到动物被孕育出来才能进行实验。这样不仅延长了实验时间，而且因为培育过程复杂，成功率比较低，导致开销很大。

　　从事基因修饰克隆猪研究近20年的赖良学，意识到如果培育一种能够在体内直接进行基因编辑的工具猪就可以解决上述问题。

　　中国科学院广州生物医药与健康研究院博士、论文第一作者王可品在接受《中国科学报》记者采访时解释说：“我们设想可以通过基因编辑技术，将能够切割基因组的蛋白基因加入到猪的基因组，这样就等于在猪的体内插入了一把基因剪刀。”而且，通过体细胞克隆获得这种带有基因剪刀的第一代工具猪，还能通过简单的配种实现世代遗传，形成带有基因剪刀的猪种群。这样实验人员就可直接在成年猪身上做实验，而不必再从胚胎期做起，从而简化并大大地加快实验流程。

　　四年的坚守

　　找到了研究方向后，2013年，赖良学又带领团队巧妙地设计了实验方案，接下来的任务，便是向着目标不断前行。

　　在实验过程中，研究人员利用基因打靶技术，将能够剪开基因的Cas9蛋白基因插入到猪基因组的特定位点ROSA26。“Cas9蛋白作为剪刀，预先埋入猪基因中。不过为了防止Cas9乱剪，所以又加入了开关。”赖良学解释说。

　　控制这一开关的关键是Cre重组酶。Cre（Cyclization Recombination Enzyme，即环化重组酶）是来源于噬菌体P1的一种酶蛋白，它可以识别催化基因中两个LoxP位点之间发生同源重组，从而造成DNA的缺失、易位等现象。这一特性在基因工程操作中得到广泛的应用，尤其在诱导型基因剔除小鼠的建立中应用得十分成功。

　　那么，将这一技术应用到猪身上能否获得成功呢？“我们做得很顺利，因为我们当时实验设计得比较好，所以第一代猪孕育出来时就得到了想要的结果。”赖良学回忆说。

　　其实，实验之所以如此顺利，也得益于赖良学多年的“修炼”。他自2007年回国之后，一直从事基因修饰猪模型的构建，在这以前在多种基因修饰猪方面都取得了重大突破，良好的基础保证了此工具猪实验的顺利进行。

　　王可品是赖良学课题组一名硕博连读的研究生，他还清晰地记得，2015年4月份的一天，克隆的工具猪诞生。“小猪生出来是下午两三点，我们需要通过分子实验来验证小猪是否是我们需要的工具猪。”为了尽快得到实验结果，王可品与其他研究人员一起在实验室中进行鉴定。

　　那一夜注定无眠。王可品和同事从下午一直忙碌到第二天清晨九点，当实验结果显示为阳性时，他们特别兴奋――他们成功了！

　　不论是第一代，还是由之繁殖起来的后代工具猪，外表和其他功能与正常家猪并无不同。“它们不会出现特异性疾病。”赖良学说。

　　关键是，在配种时，如果公猪与母猪只有一方进行了基因修饰，那么后代并非所有都会呈现阳性；如果公猪与母猪双方都完成了基因修饰，那么所孕育的全部后代会100%继承这一基因。

　　这意味着，实验人员在使用工具猪进行实验时，不需要每次都对猪的基因组进行修饰，只需要在第一代即F0代猪的基因组特定位点插入Cas9蛋白基因，就可以依靠猪的自然繁殖得到同等类型的“天生自带基因剪刀”的猪，即工具猪。

　　这只是开始

　　在等待工具猪的繁育结果过程中，赖良学还将这一技术用在狗身上。2015年，赖良学带领另一队研究人员，在狗的胚胎期使用了同样的方法，即敲掉了其中的一部分基因。这让被孕育出的小狗呈现出肌肉更发达、运动能力更强的特点。

　　因为狗在营养代谢、生理解剖、心血管系统等方面与人类极其相似，且狗较为聪明，所以会被用来进行行为学研究，适合建立帕金森氏综合征、老年痴呆等狗模型来研究人类疾病。当然，狗作为宠物，通过基因敲除来研究培育还可以用来优良遗传性状。

　　在工具猪繁育出后代以后，赖良学团队的研究人员又围绕其潜在的应用价值展开了研究。他们首先想到的是利用基因剪刀工具猪制备原发性癌症模型。

　　以前制备用于肿瘤发病机制研究和药物研发的肿瘤模型大多是将人的肿瘤细胞移植到裸鼠体内来实现的。“裸鼠是在胚胎期完全敲掉所有与免疫力相关的基因诞生的鼠类，即一出生就不带任何免疫力。”赖良学进一步解释说，“以这种方式制备的小鼠肿瘤模型，一方面因为没有免疫能力，另一方面，不是原发性肿瘤，因此与人体肿瘤的发生发展有很大的差别，用它对肿瘤药物进行有效性和安全性检测的结果95%以上不能转化为临床应用。”

　　研究人员将包装含有Cre重组酶和靶向六种肿瘤相关基因的gRNAs慢病毒通过滴鼻方式，感染工具猪的肺脏，即让猪肺细胞的基因组发生癌化突变。果然，三个月后，该工具猪出现了典型的肺癌症状和病理变化，从而成功地建立了原发性肺肿瘤大动物模型。

　　“这种工具猪可在癌症研究中发挥重要作用，因为癌症本身就是基因突变。”赖良学解释说。也因此，人体身上的其他癌症也可以通过类似的方式作用在工具猪上被复制出。

　　“以前，一个大型动物的实验就需要花费上百万元，现在有了工具猪，不仅缩短了时间，费用降低到几万元即可。”赖良学表示。

　　让异体移植离临床更近

　　无疑，赖良学团队的研究使异种器官移植往前迈入一大步。

　　众所周知，异种器官移植是国际研究的重点方向之一。2015年，美国哈佛大学的中美研究人员在美国《科学》杂志网络版上发表报告说，他们利用一种新的基因编辑技术，剔除了猪基因组中可能有害的病毒基因，从而攻克猪器官用于人体移植的一个重大难关，为需要器官移植的病人带来希望。

　　这是因为猪基因组中大约有11%的重复元件（PRE-1），这一比例与灵长类动物的重复元件副本几乎相同。有研究人员在《自然》杂志上发表的研究报告称，这些猪重复元件的结构和功能非常类似于灵长类动物的重复元件副本，暗示人类和猪之间存在比之前所认为的关系亲近得多。

　　现在，赖良学利用CRISPR/Cas9技术，对猪的基因进行改造，获得了多种免疫源性与人体更为接近的基因修饰猪，大大降低了人体异种器官的排斥反应，让异体移植距离临床越来越近。

　　另外，他们也在探索利用基因编辑猪和多能性干细胞技术培育人体器官的可能性，“比如，胰脏的发育由一个关键基因控制，即PDX1基因，所以我们只需敲掉这个基因就可以让猪不生长自己的胰脏。再在胚胎期，将人全能性干细胞注射到早期发育的胚胎，理论上，生出来的猪的胰脏就全部来自于人的细胞，那么猪长大后的胰脏与人的就可以匹配。”赖良学举例说。

　　这并非空穴来风，2016年，美国加利福尼亚大学戴维斯分校的研究团队就正试图透过向猪的胚胎注入人类干细胞，来培植出可供人体移植的器官，并希望这些“嵌合体”胚胎能为缓解世界移植器官紧缺问题提供答案。

　　工具猪、培育人体器官的猪……这些都是赖良学团队的研究内容，他将CRISPR/Cas9技术不断加入自己的理解。“现在我的学生们已经青出于蓝，他们的讨论总是能紧跟世界科技前沿动态。”这让赖良学更为激动。

　　2016年，完成博士论文的王可品选择留在了赖良学的团队，他希望未来可以利用大动物基因修饰模型为生命科学和医学作出更多贡献。